Μεθοδολογία

Υλικά και Μέθοδοι
→ Μοριακές αναλύσεις
Κατά το μήνα Ιούνιο, πραγματοποιήθηκε η δειγματοληψία ακέραιων, υγιών φύλλων από το μέσο βλαστών αντιπροσωπευτικών φυτών της ποικιλίας ‘Hayward’ και του εξεταζόμενου κλώνου. Η εξαγωγή του DNA πραγματοποιήθηκε από 100mgφυτικού ιστού με χρήση του κιτNucleoSpinPlantII (Macherey-Nagel, Γερμανία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Anonymοus, 1), ενώ για να διαπιστωθεί η καταλληλότητα του εξαχθέντος υλικού για τις αντιδράσεις PCR αυτό ποσοτικοποιήθηκε και εκτιμήθηκε η καθαρότητά του (A260/A280).
Για την εύρεση των γενετικών διαφορών μεταξύ των δύο γονοτύπων δοκιμάστηκαν 14 εκκινητές τύπου ISSR, ήτοι οι UBC: 812, 811, 841, 825, 810, 850, 818, 880, 807, 815, 808, 844, 861 και 864, η νουκλεοτιδική αλληλουχία των οποίων παρουσιάζεται στον πίνακα 1. Από αυτούς, μετά την πραγματοποίηση των προκαταρκτικών PCR αντιδράσεων, o πρώτος τελικώς απορρίφθηκε. Το διάλυμα αντίδρασης PCR ήταν κοινό για όλους τους εκκινητές που δοκιμάστηκαν και περιείχε: 1Χ KapaTaqbuffer, 5 μΜMgCl2,0,3 μΜdNTPs, 0,3 μΜεκκινητή και 1uTaqpolymerase. Το τελικό πρόγραμμα της αντίδρασης PCR που ακολουθήθηκε (θερμοκρασίες και χρόνοι) παρουσιάζεται στον πίνακα 2, ενώ οι θερμοκρασίες για τους εκκινητές που τελικά επιλέχθηκαν παρουσιάζονται στον πίνακα 3.
Hανάλυση των προϊόντων των PCR πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή αγαρόζης συγκέντρωσης 2% και η χρώση τους με διάλυμα βρωμιούχουαιθιδίου. Οι διαφορές μεταξύ των δύο γονοτύπων επισημάνθηκαν οπτικά εξαιτίας του μικρού αριθμού αυτών.